Журнал ВИЧ и ретровируса Открытый доступ

Абстрактный

Создание вирулентного полноразмерного клона кДНК для коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV)

Чжу Лунчао

Поскольку инфекционный клон MERS-CoV является важной платформой для изучения функции вирусного белка и взаимодействия вируса с хозяином. В настоящем исследовании инфекционный клон кДНК MERS-CoV (MERS-CoV-HKU), адаптированный к клеткам Vero, был создан с использованием технологии бесшовного клонирования на основе сайта рестрикции класса II BsmBI. Его геном был разделен на панель из 12 смежных фрагментов и после амплификации с помощью ПЦР фланкирован BsmBI. Фрагменты были далее собраны в бактериальные искусственные хромосомы (BAC) с использованием уникальных соединений, образованных путем переваривания эндонуклеазой BsmBI с двумя раундами клонирования. Два сайта рестрикции BsmBI внутри генома были удалены путем молчаливой мутации и установлены в качестве молекулярного маркера icMERS-CoV-HKU. Наконец, была восстановлена ​​полная длина MERS-CoV-HKU, расположенная ниже промотора CMV в BAC.

По сравнению со штаммом дикого типа HCoV-EMC/2012, MERS-CoV-HKU, выделенный инфекционным клоном, показал высокие титры на клетках Vero и Huh7. Генетический анализ выявил генетическую модификацию неструктурных белков (nsp2, nsp3, nsp14 и nsp16) и структурных белков (Spike, ORF5 и N). Синонимы мутаций были помещены в nsp2 (A2169C), nsp3 (C6172T, A6954G), nsp14 (C19514T), nsp16 (T21423G), S (A22367G, T24093A) и N (T29149A). Несинонимичные мутации были обнаружены в nsp3 (C6172T, A6954G), S (C25217T) и N (A29574T), что приводит к мутации аминокислот в nsp3 (T198I, D1702Y), S (S1251F) и N (S192T). Удивительно, но вставка трех аминокислот 'SHY' и делеция четырех нуклеотидов 'TTTA' были обнаружены в областях S2 и ORF5 соответственно.

Согласно предыдущему исследованию, RBD BatCoV-HKU4 и BatCoV-HKU25 может распознавать человеческий рецептор DPP4, но RBD BatCoV-HKU5 не может. Чтобы выяснить связь между MERS-CoV и BatCoV, были созданы инфекционный клон MERS-CoV и химерные инфекционные клоны MERS-CoV, в которых область RBD MERS была заменена областью BatCoV-HKU4, BatCoV-HKU5 и BatCoV-HKU25. Рекомбинантные инфекционные клоны MERS-CoV были дополнительно оценены на репликацию на линиях клеток Vero и Huh7.

Было показано, что наш рекомбинантный инфекционный клон MERS-CoV играет решающую роль в изучении межвидовой передачи и патогенеза коронавируса.