Американский журнал доставки лекарств и терапии Открытый доступ

Абстрактный

Оценка in vitro пероральной матричной таблетки с комплексом бета-циклодекстрина препарата II класса глипизида для лечения сахарного диабета

Раджеш

Абстрактный

Helicobacter pylori — грамотрицательная бактерия, впервые выделенная Маршаллом и Уорреном из слизистой оболочки желудка пациентов с гастритом и язвенной болезнью. Helicobacter pylori — основная причина хронической инфекции слизистой оболочки желудка, поражающая 50% населения мира. Недавно было показано, что H. pylori вызывает и другие осложнения, такие как язва желудка, воспаление двенадцатиперстной кишки и гастрит. Согласно литературным данным, у значительной части пациентов, инфицированных H. pylori, могут не развиться гастродуоденальные заболевания, и они могут оставаться бессимптомными в течение длительного периода. С другой стороны, длительные инфекции повышают риск таких состояний, как аденокарцинома и лимфома желудка.

Несколько исследований подтвердили, что H. pylori является основным канцерогенным агентом. Уровень смертности, связанный с инфекцией Helicobacter pylori, оценивается в 1 случай на 34 инфицированных мужчин и 1 случай на 60 инфицированных женщин. Helicobacter pylori вырабатывает большое количество уреазы (10% - 15% от общей массы белка), которая необходима для выживания и патогенеза H. pylori. Многие ферменты снижают кислотность непосредственной среды обитания H. pylori, производя аммиак и карбонат из мочевины. Уреаза Helicobacter pylori представляет собой мультимерный фермент с молекулярной массой 550 кДа, который собирается из двух отдельных субъединиц UreA (29,5 кДа) и UreB (66 кДа). В последнее время исследователи были озабочены разработкой вакцин против инфекций H. pylori. Среди различных антигенов-кандидатов UreB считается наиболее эффективным, поскольку иммунизация мышей очищенным UreB приводит к более высокой иммуногенности и защите, в отличие от мочевины. Выбор уреазы в качестве цели иммунизации основан на том факте, что мембранные белки часто вызывают иммунный ответ. В этом исследовании мы использовали программу прогнозирования с высокой производительностью для картирования эпитопов. С несколькими специфическими эпитопами В-лимфоцитов, расположенными рядом друг с другом, эта программа выбрала аминокислотный фрагмент гена UreB. Более того, антигенный фрагмент был экспрессирован и очищен как рекомбинантный белок штамма Escherichia coli BL21(DE3). Целью этого исследования было представить фрагмент рекомбинантного UreB (rUreB) со значительными антигенными свойствами с использованием соответствующих программ.

2. Цели

Целью данного исследования было предоставить рекомбинантный вектор, состоящий из антигенной области UreB из H. pylori, используя иммунодоминантные эпитопы антигена вместо полной последовательности и экспрессии в E. coli. Кроме того, мы стремились определить его антигенность как кандидата на вакцину и оценить его эффективность в серологической диагностике инфекции H. pylori у людей.

3. Методы

3.1. Подготовка бактерий, плазмид и других реагентов.

В этом исследовании H. pylori культивировали из биопсии пациентов с диспепсией, проходящих рутинную диагностическую эндоскопию. Перед биопсией от всех пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании. Условия культивирования определялись на основе результатов предыдущих отчетов. Изолированные образцы биопсии культивировались на агаре Brucella (Merck, Германия), содержащем триметоприм (5 мкг/мл), ванкомицин (10 мкг/мл) и амфотерицин B (2,5 мкг/мл), с добавлением 5% овечьей крови.

После инкубации в микроаэрофильных условиях в течение 3–5 дней при температуре 37 °C (CO2: 10 %) выращенные бактерии были идентифицированы как H. pylori с помощью обычных микробиологических тестов, включая окрашивание по Граму, а также тесты на оксидазу, уреазу и каталазу. Для дальнейшей оценки мы использовали векторы pET-32a и pBSK (Novagen Inc., США). Кроме того, вектор pET-32a использовался для получения белков слияния с 6-гистидиновой меткой и N-концевой меткой эпитопа T7. Эти дополнительные аминокислоты увеличили вес полученного белка до 20 кДа. В этом исследовании рестрикционные ферменты и ДНК-лигаза были приобретены у Fermentas (Литва), а штамм E. coli DH5α (Stratagene, США) использовался для первоначального клонирования. Кроме того, рекомбинантный pET-32a (pET-32a UreB) был трансформирован в E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, США) в качестве штамма-хозяина бактерий. Для рутинного бактериального культивирования мы использовали бульон Lysogeny (бульон Luria-Bertani, LB; Sigma, США). Необходимые антибиотики, включая ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34 мкг/мл; Sigma, США), были добавлены в среду LB.

Результаты: Результаты секвенирования ПЦР свидетельствовали о клонировании гена UreB в рекомбинантную плазмиду. Продукция белка была индуцирована изопропил β-D тиогалактопиранозидом (IPTG), а экспрессированный белок был очищен с помощью диализа с использованием набора Ni-NTA. Кроме того, рекомбинантный белок с молекулярной массой 42 кДа был распознан антителами в вестерн-блоттинге.

Заключение: Оценка антител показала высокие антигенные свойства иммуногенного фрагмента, предсказанные иммунологической биоинформатикой. Таким образом, рекомбинантный белок UreB может быть подходящим антигеном для разработки вакцин против H. pylori и других диагностических наборов.