Исследования генов и белков Открытый доступ

Абстрактный

Новое применение протеазы кожуры Cucurbita maxima в моющих средствах

Вадивуккараси С., Маникандан М., Павитра К. и Васудеван М.

Фермент протеазы из кожуры Cucurbita maxima был выделен и очищен, и было изучено его применение для удаления пятен крови. Было обнаружено, что оптимальные значения pH и температуры для этой недавно выделенной протеазы составляют 7,0 и 40 °C соответственно. Молекулярная масса выделенной протеазы была определена с помощью SDS PAGE, и она составила 31 кДа. Этот новый фермент протеазы был нанесен на ткань, окрашенную кровью, для оценки способности фермента удалять пятна в присутствии и в отсутствие моющих средств. Результаты подтверждают, что недавно выделенная протеаза полностью удаляет пятна с моющими средствами и даже в отсутствие моющих средств. Это исследование подтверждает применение протеазы из кожуры Cucurbita maxima для удаления пятен крови.
Термостабильный сырой протеолитический экстракт и очищенная протеаза, продуцируемые Aspergillus tamarii URM4634, были исследованы при различных температурах. Результаты активности были использованы для оценки энергии активации реакции гидролиза, катализируемой сырым экстрактом и очищенной протеазой (E* = 34,2 и 16,2 кДж/моль), а также соответствующих стандартных изменений энтальпии обратимого разворачивания фермента (ΔH°u = 31,9 и 13,9 кДж/моль). При повышении температуры с 50 до 80 °C в тестах на остаточную активность удельная константа скорости термоинактивации сырого протеолитического экстракта увеличилась с 0,0072 до 0,0378 мин−1, тогда как для очищенной протеазы — с 0,0099 до 0,0235 мин−1. Эти значения, соответствующие уменьшению периода полураспада с 96,3 до 18,3 мин и с 70,0 до 29,5 мин соответственно, позволили нам оценить энергию активации (E*d = 49,7 и 28,8 кДж/моль), энтальпию (ΔH*d = 47,0 и 26,1 кДж/моль), энтропию (ΔS*d = −141,3 и −203,1 Дж/моль К) и свободную энергию Гиббса (92,6 ≤ ΔG*d ≤ 96,6 кДж/моль и 91,8 ≤ ΔG*d ≤ 98,0 кДж/моль) термоинактивации. Такие значения предполагают, что эта протеаза, которая оказалась высокотермостабильной в обеих формах, может быть с выгодой использована в промышленных приложениях. Насколько нам известно, это первое сравнительное исследование термодинамических параметров сериновой протеазы, продуцируемой Aspergillus tamarii URM4634.
Протеазы, которые также называются «ферментами пищеварения», являются хорошо известными биокатализаторами. Они коммерчески используются в различных отраслях промышленности, таких как производство моющих средств, продуктов питания, фармацевтики, диагностических препаратов и т. д. Сообщается, что 60% всего рынка ферментов приходится на протеазы, и они считаются наиболее ценными коммерческими ферментами. Источник протеаз огромен, и бактериальные протеазы более значимы по сравнению с растительными и животными протеазами из-за их быстрого роста и возможности легкого генетически манипулирования. Однако растительные протеазы, которые обладают уникальной субстратной специфичностью, свободны от нежелательных побочных ферментативных активностей, которые отсутствуют в микробных или животных системах. Это делает ресурсы протеолитических ферментов на основе растений ценным источником, имеющим глубокие применения в ферментной промышленности. Существует минимальное количество сообщений о характеристике растительных протеаз.
Таким образом, продолжается напряженный поиск новых потенциальных растительных протеаз с целью сделать их промышленно применимыми и экономически эффективными. В настоящем исследовании было выбрано растение Citrus decumana L. (семейство Rutaceae), поскольку нет доступных отчетов о ферменте протеазе и его характеристике. Выбранное растение хорошо документировано с его медицинским применением: спазмолитическое, противовоспалительное, противокровоточивое, бронходилатирующее, противодиабетическое, противоглистное, дезинфицирующее и т. д.
Эта работа частично представлена ​​на 10-й Международной конференции по геномике и молекулярной биологии, 21-23 мая 2018 г. Барселона, Испания
Расширенный реферат
Том 1, Выпуск 1
2019
Исследования генов и белков
. Таким образом, растение выглядело как перспективный кандидат на источник протеазы, который может быть использован для его биотехнологических приложений. Таким образом, целью настоящего исследования является характеристика протеазы и частичная очистка ее из листьев Citrus decumana L. с целью коммерциализации этих протеолитических ферментов в качестве альтернативного источника.
Щелочная протеаза из щелочефильных Bacillus sp. NPST-AK15 была иммобилизована на функционализированных и нефункционализированных наночастицах с магнитным ядром типа «гремучий» в мезопористой оболочке из кремнезема (RT-MCMSS) путем физической адсорбции и ковалентного присоединения. Однако подход с ковалентным присоединением оказался лучше для иммобилизации протеазы NPST-AK15 на активированных наночастицах RT-MCMSS-NHâ‚Âá и использовался для дальнейших исследований. По сравнению со свободной протеазой иммобилизованный фермент продемонстрировал сдвиг оптимальной температуры и pH с 60 до 65 °C и pH 10,5-11,0 соответственно. В то время как свободная протеаза была полностью инактивирована после обработки в течение 1 ч при 60 °C, иммобилизованный фермент сохранял 66,5% своей первоначальной активности в аналогичных условиях. Иммобилизованная протеаза показала более высокие значения k cat и K m , чем растворимый фермент примерно в 1,3 и 1,2 раза соответственно. Кроме того, результаты показали значительное улучшение стабильности протеазы NPST-AK15 в различных органических растворителях, поверхностно-активных веществах и коммерческих моющих средствах для стирки при иммобилизации на активированных наночастицах RT-MCMSS-NHâ‚ÂàÃ. Важно отметить, что иммобилизованная протеаза сохраняла значительную каталитическую эффективность в течение десяти последовательных реакционных циклов и легко отделялась от реакционной смеси с помощью внешнего магнитного поля. Насколько нам известно, это первый отчет об иммобилизации протеазы на наночастицах кремнезема с магнитным ядром типа «гремучий» и мезопористой оболочкой, которые также не поддаются компромиссу между активностью и стабильностью. Результаты ясно показывают, что разработанная иммобилизованная ферментная система является перспективным нанобиокатализатором для различных биопроцессных приложений, требующих протеазы.